核心利用 CRISPR-Cas9 系統建立基因敲除魚模型。此技術可用於研究基因功能、疾病機制及藥物篩選等。我們提供兩種基因敲除策略:
- 單一靶點敲除(Single Target Site Knockout)此方法透過設計單一導引 RNA(sgRNA)引導 Cas9 蛋白在目標基因特定位點產生雙股 DNA 斷裂,誘導非同源性末端連接(NHEJ)修復,導致插入或刪除(indel)突變,進而破壞基因功能。此策略之優點是技術成熟,可獲得多種不同indel突變,缺點是所產生的突變較容易發生無明顯表現型。
- 大片段刪除(Large Fragment Deletion)此策略設計兩個 sgRNA,分別針對目標基因的兩個位點,使 Cas9 在兩處產生雙股 DNA 斷裂,導致中間大片段的刪除。此方法適用於移除特定功能區域或整個基因。此策略雖可以移除整段基因片段,但依據移除片段大小,其成公執行困難度亦隨之提升。
技術流程:
- 設計並合成目標基因的crRNA或sgRNA。
- 將 crRNA或sgRNA 與 Cas9 mRNA 或蛋白質共同注射至一細胞期的斑馬魚胚胎。
- 培育胚胎至適當階段,進行基因型分析以確認突變。
- 建立穩定的突變品系,用於後續研究。